化根据回归方程绘制响应值鲨肝醇纯度与3个因素的中性等高线及响应面图,见图4~6。氧化
通过对上述试验结果的铝柱分析,确定回归模型预测的层析纯化醇制成分最佳反应参数为:V二氯甲烷:V无水甲醇=9.17:0.83,上样量3.11g,分离洗脱流速1.93mL/min,鲨肝预测结果为18.08%。品及
为验证模型的其组准确性,在以上最优条件下做3次平行试验,中性结果见表4。氧化试验组平均值与预测值相对误差小于1%,铝柱说明通过响应面优化得到的参数条件准确可靠。
别对鲨肝醇与角鲨烯标准品、层析纯化醇制成分鲨鱼肝油富集前、分离后样品进行点板显色分析,鲨肝结果如7所示。品及中性氧化铝层析柱分离、纯化鲨肝醇效果明显,能将鲨鱼肝油中鲨肝醇与角鲨烯分离。
目前,市售的天然鲨肝醇产品主要指富含鲨肝醇的鲨鱼肝油,一般纯度在20%左右。本研究对影响中性氧化铝层析柱分离、纯化鲨肝醇作用效果的主要因素,即洗脱液比例、上样量及洗脱流速进行优化,得到最优参数条件,使鲨肝醇纯度达18.23%,此结果与市售鲨肝醇产品纯度相差不大。图8为鲨肝醇富集前、后的气相色谱图。鲨鱼肝油不皂化物气相检测结果如图8a所示,不皂化物中主要含有鲨肝醇与角鲨烯2种活性物质,根据面积归一法计算可得鲨肝醇含量为9.42%,角鲨烯含量为69.14%。
在洗脱液比例(V二氯甲烷:V无水甲醇)为9:1,上样量3g及洗脱流速为2mL/min条件下,鲨肝醇经中性氧化铝层析柱分离纯化后的气相色谱分析结果如图8所示,鲨肝醇含量有显著提升。仅从谱图看,鲨肝醇与角鲨烯含量的差距在缩短,鲨肝醇占18.23%,而角鲨烯占60.32%。试验结果说明中性氧化铝柱层析技术能有效分离纯化鲨鱼肝油中的鲨肝醇。
角鲨烯是由6个异戊二烯连接而成的高度不饱和的直链三萜类化合物,常温下为淡黄色或无色油状液体,具有提高缺氧耐受力功能,抑制微生物生长,抗菌消炎,调节胆固醇代谢等生物活性功效,被广泛应用于食品、医药及化妆品等行业中。角鲨烯来源广泛,存在于微生物、植物种籽、微藻、鲨鱼肝脏及人体皮脂中。然而,因植物及其加工副产物中角鲨烯含量过低而无法满足实际工业生产所需,鲨鱼肝油仍是生产高纯度角鲨烯的主要原料。鲨鱼肝油主要含有角鲨烯、烷基甘油及少量EPA、DHA、维生素A及维生素E等多种人体所需的营养素,是高品质鱼肝油之一。为了定量分析富集前、后鲨鱼肝油中角鲨烯含量的变化,绘制角鲨烯标准曲线。本研究中角鲨烯标准品气相分析结果如图9a所示,由于在测定角鲨烯标准品时未衍生化处理,故角鲨烯的出峰时间约在15.017min,比图8中的出峰时间提前了2.7min左右。角鲨烯标准曲线如图9b所示,横坐标为角鲨烯质量浓度(μg/mL),纵坐标为峰面积,线性回归方程为
y=1.921x+6.089,R2=0.9999。根据标准曲线计算可得,富集前角鲨烯纯度为54.21%,而富集后角鲨烯纯度为49.18%。分析其原因可能是:中性氧化铝层析柱对角鲨烯的吸附效果较强,而洗脱液未及时有效地将角鲨烯洗脱。一般地,常用硅胶柱分离、纯化角鲨烯,选择正己烷与乙酸乙酯复配作为洗脱液。
综上所述,中性氧化铝柱层析能有效分离纯化鲨肝醇.并对鲨鱼肝油不皂化物中的角鲨烯有筛选作用。在今后的研究中可用已脱除角鲨烯的不皂化物为原料进行鲨肝醇制品的富集纯化。
为了验证GC仪器的稳定性,在鲨鱼肝油不皂化物中添加角鲨烯标准液进行精密度及回收率的试验。本研究选取10,100,400μg/mL与800μg/mL进行试验。在相同条件下连续平行测试3d,每个质量浓度平行测定5次,计算日间精密度和日内精密度。由表5可知,在日问精密度与日内精密度检测中回收率在98.71%~101.98%,RSD在2.76~8.65,结果表明该仪器有较高的稳定性与精密度。
采用粒径100~200目的中性氧化铝为填料,研究其柱层析制备鲨肝醇制品的方法。采用TLC对样品进行定性分析,GC对样品进行定量分析并验证仪器稳定性与精密度。采用响应面法优化中性氧化铝柱层析分离、纯化鲨肝醇工艺参数,得到最佳反应参数为:洗脱液比例(V二氯甲烷:V无水甲醇)9:1,上样量3g,洗脱流速2mL/min,所得鲨肝醇制品纯度达18.23%。对鲨肝醇富集前、后的组成成分分析可知,中性氧化铝柱层析分离、纯化鲨肝醇的同时,会对不皂化物中角鲨烯的含量造成损失。角鲨烯纯度由54.21%减至49.18%。本文尚未有效分离鲨鱼肝油不皂化物中的鲨肝醇与角鲨烯,今后将继续开展鲨肝醇分离纯化技术及功能活性等研究。
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